现实一 自拍偷拍 吃瓜 葡萄酒酵母的筛选自拍偷拍 吃瓜
葡萄酒型野生酵母在葡萄皮上附着的甚多，是以分离这类醉母并诽谤事，高出关于遴荐当地特产葡萄酿制真有独特仪态的葡萄酒，分离土产货的葡萄酒型酵母十分必要。然而单分离如故不够的，分离后还必须作念酿酒考验，在赢得试吃及格的闭幕后，该分离酵母就可链接作坐褥考验，并逐渐用于坐褥。
（一）材料
1．分离源：自葡萄园收罗数十克葡萄。
2．培养基：取改过鲜葡萄的榨汁，加2%琼脂，若pH小于4，宜疗养pH至4~4.5。然后0.6公斤/厘米，20分钟灭菌。可用于斜面，也用于平皿分离用。
3．试管、平皿、接种环，培养箱、漏斗．
（二）操作智商
1．自葡萄园收罗崭新葡萄数十克，将葡萄用剪刀从枝上剪下。
2．将四层清净纱布铺平，放上葡萄包起来然后用手将葡萄汁挤出，通过漏斗入试管中。于30℃增殖培养48小时，此即为分离源。
3．倒培养基入平皿，待其凝固．取一接种环，沾取葡萄汁，分别划线分离，至30℃培养箱培养。
4．培养48小时，将长出之菌落接入斜面．可随即挑取数十个菌落，但应挑分离成单个的，以免不纯。
5．进行微型酿酒考验。
现实二 紫外线的诱变育种
紫外线诱变一般遴荐15瓦紫外线杀菌灯，波长主要为2537埃．灯与处理物的距离为15-30厘米，照耀时辰依菌种而异，一般为几秒至几分钟。紫外线的剂量若灯的功率为30瓦，距离为3厘米时，每平方毫米每秒为53尔格。一般以细胞的圆寂率暗示。举例如照耀的剂量圆寂率截止在70-80%为宜。
被照耀的菌悬液细胞数，细菌为108个／毫升足下，霉菌孢子和酵母细菌为106-107个/毫升。由于紫外线穿透力不彊，要求照耀液不要太深，约2~4毫米厚，同期要用电磁搅动器或手工进行摇动，以免照耀不均匀。由于紫外线照耀后有光回见效应，是以凡在照耀时和照耀后的处理当在红灯下处理。、
（一）材料
1．菌种：枯草杆菌AS1.398。经18-20小时肉汁卵白胨培养液摇瓶培养18-20小时。
2．培养基：牛肉汁卵白陈固体和液体培养基。无菌生理盐水。
3．用具：10毫升、1毫升无菌吸管，培养皿，试管，三角瓶，摇床，培养箱，离神思，15瓦紫外灯，磁力搅动器，漏斗，玻璃珠等。
（二）操作智商
1．将菌培养液3000转/分离心5分钟，倾去上清液，将菌体打散加入无菌生理盐水再离心洗涤。
2．将菌液放入灭菌过，有玻璃珠的三角瓶内用手摇动，以打散菌体。将菌液倒入有定性滤纸的漏斗内过滤，单细胞滤液入试管，一般处于混浊态的细胞液含细胞数可达108/毫升足下，此看成待处理菌悬液。
3．取4-5毫升制备菌液入9厘米培养皿内，放入一无菌磁力搅动捧，于磁力搅动器上，在15瓦紫外线下30厘米处。在正经照耀前，应先绽开紫外线10分钟让紫外灯预热，然后开启皿盖正经在搅动下照耀10-50秒钟。操作均应在红灯下进行，或外用黑纸包住，幸免白炽光。
4．取未照耀的制备菌液和照耀菌液各0.5毫升进行稀释分离，估计活菌细胞数。
5．取照耀菌液2毫升于液体培养基中（300毫升瓶，30毫升培养液）进行中间摇瓶培养4小时。
6．取中间培养液稀释分离，培养。
7．挑取菌落进行筛选。
未照耀菌液菌数／毫升-照耀菌液菌数／毫升
圆寂率%= 未照耀菌液菌数 *100%
现实三 养分颓势型的筛选
（一）材料
1．菌种：啤酒酵母，经诱变，中间培养的菌悬浮液。
2．培养基：CM：卵白胨2克，酵母浸汁1克，葡萄糖2克，琼脂2克，水100毫升，pH6.0/厘米2灭菌30分钟。葡萄糖2克，KH2PO4 0.l克，MgSO4.7H2O 0.05克，琼脂粉1.5克，蒸馏水l00毫升，pH6.0，0.6公斤/厘米2灭菌15分钟。若不加入(NH4)2SO4和琼脂粉即为无氮液体MM，缓冲液0.1MpH6.0磷酸缓冲液。
3．试剂：制霉菌素
4．用具：无菌吸管、试管、培养皿、离神思、培养箱。
（二）操作智商
1．取10毫升经15小时中间培养的菌液离心洗涤二次，悬浮于10毫升无氮MM液于三角瓶中，要求细胞浓度为108个毫升，取1毫升菌液至无氮MM中，漂浮培养3.5小时。
2．于漂浮液中补加1毫升1克／毫升(NH4)2SO4，再加入1毫升浓度为l00微克/毫升的制霉菌素液3 C链接培养2小时。
3．稀释分离，分离得的菌落于CM和MM培养基上点种筛选颓势型，将选得的颓势菌落划线分离，挑取20个分离菌落再在MM和CM上点种培养，登第细办法颓势型菌落。
4．滋长谱测定，并传代考据。
5．将细办法养分颓势型菌株接入斜面作进一步考验。
现实四 葡萄酒的发酵
葡萄酒品种茂盛，一般按激情，糖分若干，有莫得添加白兰地或乙醇，含不含CO2或酒的产地来分类。
红葡萄洒是用带色果皮的葡萄制成，含有果皮或果肉中的有色物资，酒色深红，鲜灯或 红坚持色，干红葡萄酒含洒精9~13%。
白葡萄酒是用白葡萄或红葡萄的果汁制成，明朗淡黄或金黄色，乙醇一般在9~13%。
葡萄酒发酵不错遴荐自然发酵和纯种发酵二种形势。
（一）材料
1．菌钟：葡萄酒酵母
2．葡萄：白葡萄酒用一般糖度的白葡萄，红葡萄酒用红玄色葡萄，及砂糖。
3．用具：棉塞三角瓶(1升)，大漏斗（直径15公分），蒸锅、调羹、纱布、牛皮纸、天平、温度计、糖度计（0～30％）、pH纸，培养箱。
（二）操作智商
砂糖
原料葡萄——除梗——压榨——葡萄汁+搀杂——发酵原液——注入三角瓶——干冷灭菌——放凉——加酵母——发酵——过滤——制品。
2．原料的调制及发酵原料的调制。
团结般果汁的制法调换，但红葡萄酒不除种子及皮。对1升三角瓶，需准备红葡萄700克或白葡萄1000克。葡萄汁加砂糖调整糖度至发酵最适的24%的糖度，此为发酵原汁。其估计花样如下：
设果实原糖度为d%，总量为G公斤，现要配制成24%（a%）的发酵原汁，须加糖若干克(x): G*d%十x = 24 (或 a )
G+x 100 100
3．将发酵原汁如入三角瓶达容器高度的1/2为宜。
4．灭菌：塞上棉塞，上包牛皮纸，60℃灭菌20分钟，凉至30℃，加入纯培养菌100毫升足下。
若进行当然发酵，则无用灭菌。
5．发酵与处置：28~30℃恒温培养发酵，每天振摇一次，不宜过多。主发酵约7~10天发酵罢手后，过滤之。尔后插足后发酵，后发酵时代过滤2~3天，即得知晓液。
现实五 发酵经由中微生物滋长、大小和数量的检测
微生物的培养发育，包括培养微生物细胞个体数量的加多（增殖）和细胞物资的加多（成长）。一般在培养微生物时，细胞数量的加多，与细胞物资量的加多之间不一定存在比例干系。但在发育活跃地进行，况兼自在地保持下去，则细胞数量和细胞质料平庸就成比例。
1．细胞物资量的测定
（1）干重：将洗净的菌体置于放有干燥剂的干燥器减压干燥，或加热烘干后称重。一般可将洗净菌体摊开于名义玻璃上薄薄一层，然后放红外线烘干器或110一120℃烘箱，烘干至恒重再称量。
(2)菌体含氮量：卵白质是细胞因素的基本组份，每类微生物细胞的卵白质含量实在恒定，如细菌酵母卵白质含量皆占干重的40～60％，霉菌少些。因此将洗涤过的菌体用克氏微量定氮法测定，不错暗示出细胞物资的量。
上述两法可用于单细胞细菌、酵母、菌丝、孢子等。
2、细胞菌数估计法，有几种花样如表：
多样菌数时代相比
花样 确立 适用菌类 临了稀释液 时弊% 操作
浓度（个/毫升）
计数器法 血球计数板 细菌酵母孢子 106~108 8 菌液吸入计数板与盖片的裂缝中的凹体积内，镜检计数。
平皿法 平皿 细菌酵母孢子 150~1500 以0.2毫升临了稀释液滴于琼脂平皿名义，涂抹培养计数。
毛细管法 容器0.5毫升 厌氧细菌 500~10000 11 以0.2毫升的临了稀释液与4.5
有刻度毛细管 兼性酵母 毫升的1%熔解琼脂培养基相搀杂，吸入毛细管中，凝固，培养，计数。
稀释法 液体培养基试管 细菌酵母 1~10 1~3.3 以10、1、0.1毫升的临了稀释液各入5只试管的培养基中接种。
比浊法 光电比色器 细菌 106~109 培养液应无色，或以对照消去，进行比色，按消光度的比转。
其中平皿法、毛细管法、稀释法得出的数据为活菌数，而计数器法和比浊法是总菌数的测定。但计数法中若用次甲基兰液染色，则色蓝者为死细胞，活细胞淡蓝色，以资区别。
酵母细胞数的测定
独揽血球计数板在显微镜下成功计数，这是一种常用的微生物计数法。此法是将菌悬液放在血球计数器载玻片与盖玻片之间的计数室中，在显微镜下进行计数。由于载玻片上的计数室盖上盖玻片后的容积是一定的，是以把柄在显微镜下不雅察到的微生物数量来估计单元体积内的微生物总额目。
血球计数板上有四条槽而组成三个平合。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽隔成两半。每个半边上头各刻有一个计数区，每分离好多大格，其中中央的25个中格为计数区。每个中格又分为16个小方格，即中央大格有25*16=400个小方格组成。每个大方格边长为1毫米，即面积为1平方毫米。盖上盖玻片，载片与盖片间的距离为0.1毫米，于是每大格的体积为0.1毫米3。在计数时，平庸数五个中格的总菌数，求得平均值，再乘以25得一大格即0.1毫米3的菌数含量。
估计：A每格中为平均菌数。B为菌液稀释倍数。
则1毫升中菌体数＝A*25*10*1000*B
＝250000A·B个
＝2.5*105A·B个
1、材料
（1）菌液：啤酒酵母发液。
（2）用具：血球计数板，盖玻片，无菌水、无菌试管，玻棒、无菌吸管、显微镜。
2、操作智商
（1）将原菌液稀释50倍。取0.5毫升稀释菌液入无菌试管内，吸取1％次亚基蓝液入内混均匀。
（2）取清洁干净的血球计数板，加盖玻片于中央，用无菌玻棒沾取染色菌液于盖片周围碰及，依靠毛细作用吸入菌液．贯注不可产不悦泡，将余液用吸水纸吸去。
（3）静止5分钟，让菌细胞千里于计数器内，脱手计数。贯注在中格四周的酵母，处于线上的细胞其计数原则是四条边框二边计数，二边不计。酵母的芽在未脱离母细胞前，芽已达母细胞1/2大小可计数。深蓝色为死细胞或朽迈细胞，非着色的为一般活细胞。
(4)计数五个中格，然后平均将每中格细胞数代入公式，求出细胞总额。
(5)清洗：用毕后用水冲去计数区，让其自行凉干。
其他现实参见《微生物学现实》（沈萍，范秀容，李广武主编，高档讲明出书社，2002），现实十五 微生物大小的测定，现实二十九 平板菌落计数法，现实三十 光电比浊计数法，现实三十一 大肠杆菌滋长弧线的测定
现实六 固定化滋长酵母细胞贯穿坐褥乙醇
固定化细饱已应用到L-天冬氨酸和L-富马酸等的工业坐褥。由于发酵坐褥频频需ATP再生和辅酶的多级响应，是以要求固定化细胞能处于一种活的景色，即在固定化伏态下仍能链接滋长、繁衍。这即是所谓固定化滋长细胞。其重心是流入的不仅是糖，况兼如故十足培养基。本现实是遴荐该种体式进行乙醇发酵。
（一）材料
1．菌种：乙醇酵母或卡氏酵母
2．培养基：
①种子培养基：1％葡萄糖，0.5％卵白胨，0.3％酵母膏和0.3％麦芽汁，pH5.0
②十足培养基：10％葡萄糖，0.15％酵母膏，0.25％NH4Cl. 0.55％K2HPO4，0.025%MgSO4·7H2O，0.1％NaCl，0.001％CaCl2和0.3％柠檬酸，pH5.0。
（二）操作智商
1．接种入种子培养基中30℃漂浮培养18小时.
2．固定化：将种子培养液1毫升与4%的角叉菜胶溶液50毫升于37 C搀杂。将这种混和物在20℃滴加到渺小搅动的2%KCl溶液中，酿成了包埋有少许细胞的凝胶珠。具平均直径为4毫米。
3．凝胶珠的再培养：将上述凝胶珠10毫升加到含有100毫升十足培养基的三角瓶中，30℃旋转式摇床上培养60小时，这时的凝胶珠称固定化的滋长酵母细胞。
4．用柱式法贯穿发酵坐褥乙醇：将50毫升固定化滋长酵母细胞凝胶装入12.5*2.8厘米的柱中，然后以每小时50毫升的速率30℃加入十足培养基。流出液中即含有5％浓度的洒精，共发酵成果接近100％。也可将包埋少许细胞的凝胶珠成功装入柱中，然后30℃流加十足培养基，待包埋细胞在凝胶中滋长繁衍直至达到自在态，就可插足贯穿发酵景色。
附：固定化细胞数量的测定
固定化细胞是包埋或吸附于载体之中的细胞，因此与测定游离细胞的花样有区别。这里是测定包埋于凝胶中酵母细胞数的花样。
（一）材料
1．待测凝胶珠
2．培养基：遴荐培养酵母的十足培养基。
3．器材：生理盐水、吸管、试管、平皿、三角瓶、摇瓶机、培养箱。
（二）操作智商
1．将从培养基中取出的二粒凝胶珠溶解在5毫升生理盐水中，30℃渺小漂浮15分钟。酿成细胞悬液。
2．遴荐稀释法系列稀释分离。30℃培养2天，计数，算出每毫升凝胶中的活细胞数。
现实七 L1523型微型发酵罐的构造
一、现实规划
老成微型发酵罐的构造，了解发酵罐多样构造的功能。
二、微型发酵罐的构造
微型发酵罐是现实室进行小限制考验研究的必备安装，图1所示为瑞士比欧生物工程公司坐褥的L1523型微型发酵罐、主要由罐体、通气系统、搅动系统、加热及控温系统、监测及截止系统等几个部分组成。
图1 L1523型发酵罐的外不雅
图2 罐体外不雅 图3 罐体（vessel）
图4 罐盖（lid） 图5 罐底（bottom） 图6 搅动器（disc turbine）
图7 防护罩（safety jacket） 图8加热器和直流电机（heater and AC motor）
图9 空压机（air compressor） 图10 安全阀（safety valve）
1．罐体
罐体是发酵坐褥微生物菌体或代谢产品的局势，一般由不锈钢、陶瓷或特种玻璃制成，其体积把柄需要可从0.1升到100升不等。L1523型发酵罐的体积为19升，发酵罐的外形参见图2，由罐盖（图4)，罐体（图3)和罐底（图5)组成。
（1)罐盖：由耐腐蚀的不锈钢组成，其上有十二个圆孔，分别用于安装pH探头、温度探头、溶解氧探头、气压表、疗养pH的补酸、补碱管、排气管过滤器、通气管、放样管和安全阀（图10），围聚外侧的两个孔一般用塞子塞住，主要用于接种、加消泡剂等。
(2)罐体：由耐高温、高压的特种玻璃制成，其内有多样探头、通气管、放样管、搅动器（图6)和挡板等。
(3)罐底：由具夹层的不锈钢制成，夹层内与加热器和冷却水联通，通过此夹层与发酵罐进行热交换，以截止罐内温度。搅动器亦然通过罐底插足罐体的，称为下搅动，此外皮罐底还有空气漫衍器，能使压缩空气均匀漫衍于发酵罐中。
2．通气系统
L1523型发酵罐适用于好气性微生物的发酵坐褥，其空气开端于空气压缩机（图9）a由空压机压缩的高压空气经除油、除水和减压安装减压后，通过事前灭菌的空气过滤器过滤除菌，然后再经空气漫衍器、搅动器和挡板等的共同作用，使无菌空气均匀地漫衍到扫数发酵罐。
3．搅动系统
发酵罐的搅动安装可分为上搅动和下搅动两种类型，L1523型发酵罐属于下搅动，其搅动器（图6）由搅动电机（图8）驱动，转速高达1000rpm。
4．加热与控温系统
L1523发酵罐为原位灭菌发酵罐，独揽自带的微型加热器（汽锅，图8），可进行培养基的灭菌和保温，再借助于冷却水（自来水）可使发酵罐内的灭菌温度和发酵温度精准地保持恒定（时弊为士0.1 C）。
5．监测及截止系统
微型发酵罐一般皆配备有监测截止系统，不错监测和截止搅动器的转速、灭菌和发酵的温度、pH值、溶解氧量等。L1523型发酵罐可通过估计机杀青自动截止，中间可借助蠕动泵和补料系统自动补料和疗养pH值等。
现实八 枯草杆菌的发酵坐褥
一、现实规划
通过本体操作进一步老成微型发酵罐的构造；掌捏微型发酵罐的使用花样；了解微生物发酵坐褥的花样。
二、现实器材的准备
（一）培养基的制备与灭菌
1．斜面菌种培养基
牛肉膏卵白陈固体斜面培养基：牛肉膏5.0g，卵白陈10.0g，氯化钠5.0g，琼脂20.0g，水1000ml，pH7.2-7.4，0.1MPa， 121℃，灭菌30min。
每组配制500m1固体培养基，分别装入20支15*150mm试管（每管约5m1)和3个250m1三角瓶中，然后包装、灭菌。试管摆成斜面。
2．三角瓶种子培养基
牛肉膏卵白脉液体培养基：配方同上，但不加琼脂。
每组配制上述液体培养基1000m1，分装到10个250m1三角瓶中，每瓶1000ml。灭菌花样同上。
（二）其他现实器材的准备
l．lml无菌吸管
每组30支，于0.1 Mpa， 121'C灭菌30分钟。
2．无菌水
18 X 180mm试管，每支装4.5m1水，每组40支，于O.1Mpa， 121℃灭菌30分钟。
3．无菌培养皿
每组40套，于0.1 Mpa，121℃灭菌30分钟。
4．无菌空三角瓶
每组10个，于O.1Mpa， 121℃灭菌30分钟。
5．无菌吸管
1 ml吸管，每组20支，于0.1 Mpa，121℃灭菌30分钟。
6．空气过滤器的灭菌
将空气过滤器针尖先用纱布包扎好，然后再用包装纸和绳索将空气过滤器合座包装好，于0.1 Mpa，121℃灭菌30分钟。
7．牛津杯的灭菌
将50只牛津杯装入培养皿中，每皿10只，用包装纸包装好，于0.1MPa，121℃灭菌30分钟。
8．消泡剂的灭菌
量取100m1豆油倒入250m1三角瓶中（每组3-4瓶），包装好后于0.1 Mpa，121℃，灭菌30分钟。
9．75%和95%的乙醇棉球各一瓶
三、细菌细胞浓度的测定（比浊法）
1．法子弧线的制作
取无菌水7支，编号，将在30℃、150rpm条目下培养20~22小时的枯草杆菌细胞按二倍系列稀释法进行合适稀释，使其浓度分别为原液、1/2，1/4，1/8，1/16，1/32，1/64，1/128原液，然后，遴荐平板菌落计数法测定其中的细胞数量，同期以无菌水看成空缺对照，独揽分光光度计测定其在580nm波长下的O.D.值。
以O.D.值看成纵坐标，每ml样品中的细胞数看成横坐标，绘图法子弧线。
2．发酵液细胞浓度的测定
从取样管放出10ml足下的发酵液至无菌三角瓶中，在580nm波长下，测定发酵液的O.D.值，对照法子弧线，可知该发酵液的细胞浓度。
四、发酵坐褥
1．斜面菌种的培养
将已活化两次的试管斜面菌种接种到试管斜面上，30℃培养18~20小时，即为斜面菌种。
2．三角瓶种子的培养
将试管斜面用4.5m1无菌水洗下，然后接种到三角瓶培养基中，每瓶一管，于30℃，150rpm条目下，漂浮培养18~20小时。
3．发酵培养基的灭菌
每组配制12L牛肉膏卵白脉液体培养基(pH7.4)，用乳胶管堤防肠加入发酵罐中，然后旋紧塞子，安装好防护罩（见图7)，按底下的花样灭菌：
（1）搜检水、电、气以及发酵罐的密封性是否泛泛。如泛泛即可灭菌。
(2)插上水泵电源，截止进水阀和出水阀，疗养水压使水压表指针诱骗在0.25~0.3之间，使水充满加热器，注重烧坏加热器。
(3)大开拓酵罐的总电源。
(4)大开搅动器的电源开关，使搅动器转速截止在300-350rpm。
(5)合适开启排气口排气，但应贯注：排气口不可开得过大，不然，培养基的水分牺牲严重！！
(6)大开温度截止器的电源开关，将灭菌温度设定为121℃，灭菌时辰设定为30min，发酵温度设定为30'C.启动灭菌开关，进行自动灭菌。
贯注： 1.灭菌经由中决不可离开东谈主！！应随时不雅察发酵罐有无颠倒情况，如出现颠倒应实时请西席处理或关闭总电源。
2.发酵罐的玻璃不可战争冷水！！
3.发酵罐灭菌参数照旧确立好，未经西席允许，不得浮松蜕变！！
(7)灭菌闭幕后，发酵罐会自动降温，当温度低于90℃时，通过无菌操作，
安装好已灭菌的空气过滤器，然后，通入无菌空气，使培养基快速降温，并
使发酵罐保持一定的正压，以减少羞耻。
(8)当温度低于35℃时即可接种发酵。
4．接种
在发酵罐的罐盖上弃取一个塞子，先用75%的乙醇棉球在其周围消毒，同期消毒尖嘴钳，然后在塞子周围舍弃吸满无水乙醇的棉花，点火乙醇，用钳子堤防大开塞子，取出置于火焰上，将三角瓶种子按5%的接种量飞速倒入发酵罐内，旋紧塞子。
5．发酵
将驱动溶解氧浓度疗养至95%以上，搅动速率设定为350rpm，发酵温度设定为30℃，脱手计时发酵。发酵时辰把柄细菌滋长情况而定，一般约70小时。
发酵经由中，应贯注：
（1)溶解氧的斜率一般不得低于50%，不然需加大搅动速率或合适增大通气量。
(2）发酵经由中，应平庸不雅察并记载发酵罐里面的变化情况，如泡沫过多，应实时消泡。消泡花样是遴荐无菌操作时代，大开拓酵罐盖顶的一个塞子，加入消泡剂（豆油），每次一瓶（l00ml），但每批次发酵最多不越过4瓶。
(3）发酵经由中应实时记载发酵参数的变化情况。
发酵闭幕后，应实时的清洗发酵罐和现实用品。
贯注：发酵罐体不可用盐酸清洗。
小二先生 调教6.绘图枯草杆菌的滋长弧线
发酵培养基接种后，从0， 1、2， 3、4、6， 8， 10， 12， 14， 16、18、20， 24， 26， 28， 30，……小时，分别取样测定发酵液的O.D.值，绘图出枯草杆菌的滋长弧线。
现实九 抗生素的检测
一、现实规划
通过现实掌捏抗生素的一般检测花样。
二、PDA培养基的制备
称取去皮马铃薯200g，切片，放入小锅中，加入1000m1水，加热煮沸10-15分钟，用8层纱布过滤。取滤液加入蔗糖20g，琼脂20g，加热熔化后补足水分（当然pH)，然后，分装到20支15 X 150mm试管< 5m1/支）和6个250m1三角瓶（150m1/瓶）中，于O.1Mpa， 121℃灭菌30分钟。
三、抗生素的检测花样
1．将黑曲霉用PDA培养基活化，然后接种到PDA试管斜面上，培养36-48h。
2．取2套无菌培养皿倒入PDA培养基，冷凝后置30℃温箱中过夜。
3．将培养好的黑曲霉试管斜面用4.5m1无菌水洗下，然后将菌悬液分别倒入两套PDA平板上，用玻璃涂棒涂匀。
4．遴荐无菌操作，用无菌小镊子将牛津杯轻轻放在培养基上。每皿放两只，并作好标一记（参见下图）。
5．分别将发酵20， 30， 40， 50， 60h的发酵液用无菌三角瓶取出，用I ml无菌吸管吸取0.5m1发酵液至一只牛津杯内，另一只加入0.5m1无菌水，共两个重叠。
6．静置30min，将培养皿堤防放入30℃温箱中，培养48h，不雅察并记载抑菌圈的大小。
贯注：现实经由中，尽量不要挪动牛津杯。